Tecniche di biochimica e biochimica post-genomica
La ricerca biochimica. Sperimentazione biochimica. Cenni di Microscopia.
Colture cellulari
Campioni biologici
Omogenizzazione: scelta delle metodiche e dei media.
Tecniche centrifugative: principii della sedimentazione; velocità, RCF, coefficiente di sedimentazione e tempi di sedimentazione. Centrifughe e rotori. Centrifugazione differenziale, Centrifugazione in gradiente di densità, zonale e isopicnica. Applicazioni
Precipitazione frazionata di proteine; precipitazione con solventi e polimeri organici; precipitazione al calore.Dialisi ed ultrafiltrazione: principii ed applicazioni.Estrazione
Tecniche cromatografiche: Cromatografia su colonna.
Cromatografia di adsorbimento e ripartizione. Cenni sulla TLC: cromatografia bidimensionale. Cromatografia idrofobica di proteine (HIC).
Cromatografia a scambio ionico di proteine. Analizzatore automatico di amminoacidi. Cromatografia ad esclusione (gel filtrazione). Cromatografia di affinità. Immunoaffinità. Cromatografia con coloranti e con lectine. Cromatografia con metalli; purificazione di proteine “etichettate” con istidina. Purificazione di proteine ricombinanti.HPLC.
Purificazione di enzimi: attività specifica e resa. Enzimi immobilizzati.
Determinazione della sequenza di proteine (sequenziamento di Edman e mediante spettrometria di massa)Tecniche elettroforetiche: principii generali, fattori che influenzano la mobilità elettroforetica. Elettroforesi in fase libera. Elettroforesi zonale su acetato di cellulosa; proteine seriche. Elettroforesi su gel: PAGE, PAGE-SDS, Agarosio. Metodi di rivelazione e valutazioni quantitative. Blotting - Western blotting nello studio delle proteine: applicazioni biochimiche e diagnostiche.Focalizzazione isoelettrica (IEF). Elettroforesi bidimensionale.
Tecniche spettroscopiche Spettrofotometria UV-VIS in Biochimica. Relazione di Lambert-Beer. Dosaggi colorimetrici.
Tecniche enzimatiche. Richiami di cinetica enzimatica: velocità iniziale, effetto della concentrazione di enzima e substrato, pH e temperatura. Inibizione irreversibile e reversibile. Inibitori competitivi, non competitivi, acompetitivi. Modificazione chimica di proteine, inibitori come farmaci. Dosaggio dell'attività enzimatica: metodi continui, discontinui, diretti, indiretti e accoppiati.
Valutazione di enzimi e metaboliti plasmatici/serici a scopo diagnostico. Tipologie delle analisi biochimico cliniche di laboratorio. Il prelievo di sangue . Enzimi presenti nei materiali biologici, loro dosaggio e significato clinico della valutazione dell'attività. Caratteristiche generali, ruolo biochimico e metodi di dosaggio dei principali enzimi di interesse clinico: LDH, CPK, AST e ALT, fosfatasi alcalina, colinesterasi. Profili enzimatici: cardiaco, epatico e pancreatico. Metaboliti di interesse clinico
Tecniche immunochimiche. Struttura degli anticorpi, reazione antigene-anticorpo. Produzione di antisieri, anticorpi monoclonali. Metodi di analisi: reazione di immunoprecipitazione in fase libera ed in gel, immunodiffusione; metodi radioimmunologici: RIA ed IRMA; dosaggi immunoenzimatici: EMIT, ELISA e PEIA. Dosaggi ormonali: metodiche e applicazioni. Diagnosi di laboratorio della gravidanza
Tecniche di biologia molecolare. Tecnologia del DNA ricombinante: principi generali. Reazione a Catena della Polimerasi (PCR) Identificazione di specifiche sequenze di DNA ed RNA: ibridizzazione di Southern (Southern blotting) e applicazioni nella diagnosi di malattie genetiche. Northern blotting e applicazioni nello studio dell'espressione genica. Valutazione dell'espressione genica: la tecnica del DNA microarray.